?合成生物學(xué)是指對生物體進行有目標的設(shè)計、改造、重新合成，甚至創(chuàng)建并賦予其非自然功能的“人造生命”。無細胞合成生物學(xué)正在發(fā)展成為其中一種強大有效的手段，其目的是在不使用整個活細胞的情況下，理解、利用和擴展自然生物系統(tǒng)的功能。

無細胞蛋白質(zhì)合成亦被稱為體外蛋白質(zhì)，是一種用于補充基于細胞的蛋白質(zhì)表達的技術(shù)，其合成系統(tǒng)無需完整的活細胞就可以在體外受控環(huán)境中模擬整個細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，并允許對單個成分和反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進行詳細深入的研究。

因此，無細胞蛋白質(zhì)合成作為一種平臺技術(shù)，有望克服當前胞內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)中因為細胞膜約束帶來的表達局限性，在基礎(chǔ)科學(xué)研究和應(yīng)用科學(xué)研究中具有廣闊的前景。

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)概述

無細胞蛋白質(zhì)合成（cell-free protein synthesis，CFPS）是無細胞合成生物學(xué)的技術(shù)核心，也被稱為體外蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯技術(shù)，該技術(shù)作為基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)的研究工具已經(jīng)使用了近70年。

CFPS通過提取核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和能量代謝所必需的元素，并向其中添加DNA模板、能量和各種輔因子，模仿胞內(nèi)環(huán)境以合成目標蛋白質(zhì)。

CFPS系統(tǒng)最初是由Nirenberg和Matthaei在20世紀60年代開發(fā)的，在發(fā)現(xiàn)遺傳密碼方面發(fā)揮了重要作用。在過去的20年里，CFPS系統(tǒng)經(jīng)歷了飛速的發(fā)展，以滿足對廉價和快速重組蛋白表達技術(shù)的日益增長的需求，這導(dǎo)致了眾多高活性CFPS平臺的發(fā)展。通過PubMed搜索關(guān)鍵詞“cell-free protein synthesis”分析1953—2020年公開論文發(fā)表數(shù)量，可以看到CFPS技術(shù)一直受到廣泛的使用和關(guān)注。

 

圖 | 每年CFPS論文發(fā)表數(shù)量（來源：CSCD）

CFPS之所以能夠飛速發(fā)展，主要是其具有快速表達具生物活性重組蛋白的潛力。具有這種潛力的主要原因是其相較于細胞體系的特有優(yōu)勢。

首先，CFPS系統(tǒng)使用細胞提取物來模擬細胞內(nèi)的環(huán)境，無需完整的活細胞且沒有細胞膜的限制，是一個開放的合成系統(tǒng)。

其次，系統(tǒng)中的所有物質(zhì)與能量都可以用于生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)，大大提高了蛋白質(zhì)的表達效率。這些優(yōu)勢克服了傳統(tǒng)的基于細胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的很多局限性。

此外，CFPS可以使用線性DNA作為表達模板，避免了基于質(zhì)粒方法克隆步驟的耗時問題，使CFPS系統(tǒng)成為有潛力的高通量篩選工具。

 

圖 | 體內(nèi)細胞和體外無細胞蛋白質(zhì)合成比較（來源：CSCD）

隨著CFPS的快速發(fā)展，CFPS系統(tǒng)類型已經(jīng)多種多樣。一類是提取物系統(tǒng)，根據(jù)細胞的提取物類型可分為高使用率模式細胞類型和低使用率非模式細胞類型。高使用率模式細胞類型主要包括大腸桿菌、酵母、小麥胚芽、昆蟲、中國倉鼠卵巢和兔網(wǎng)織紅細胞等。

無細胞人工“生命體系”構(gòu)建中的應(yīng)用和研究進展

為合成具有新的特性、結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，應(yīng)在CFPS體系中加入編碼該蛋白的DNA或mRNA模板，以及氨基酸和核苷酸等來啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。CFPS系統(tǒng)利用微生物、植物或動物細胞的粗提物產(chǎn)生核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和能量代謝所必需的元素。

傳統(tǒng)的無細胞反應(yīng)模式包括兩類：批式反應(yīng)和連續(xù)交換反應(yīng)系統(tǒng)。批式反應(yīng)裝置簡單，較易實現(xiàn)，所有的無細胞反應(yīng)組分添加到一個試管中，可以快速合成目標蛋白質(zhì)。然而，這種反應(yīng)模式存在局限性，能量和氨基酸的消耗以及副產(chǎn)物的積累，特別是副產(chǎn)物對體外轉(zhuǎn)錄/翻譯有抑制作用，使得產(chǎn)率低下。為克服該缺點，科學(xué)家設(shè)計了連續(xù)交換無細胞反應(yīng)系統(tǒng)。

 

圖 | 無細胞蛋白合成過程（來源：CSCD）

CFPS技術(shù)已實現(xiàn)了廉價且快速的重組蛋白質(zhì)表達，其靈活性、可控性以及操作便捷等優(yōu)勢迅速擴大其用途并逐步商業(yè)化。目前，各種原核和真核生物的無細胞平臺已經(jīng)投入使用。

以人工生命體系的構(gòu)建為例，主要有分兩步，一是噬菌體的合成；二是人工細胞的構(gòu)筑。

噬菌體的合成：由于噬菌體對宿主的極端特異性，以及顯示出作為抗菌劑和細菌診斷的巨大醫(yī)學(xué)潛力，噬菌體目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗菌劑的研發(fā)、細菌診斷、疫苗研發(fā)、噬菌體聚合酶的合成以及用作遺傳可編程生物材料的支架等多個方面，并且在定向進化研究中發(fā)揮重要作用。然而，大多數(shù)噬菌體的基因組太大（>20 kb），很難在體外進行操作，而且對細菌宿主是致命的；體外轉(zhuǎn)錄翻譯無細胞表達系統(tǒng)，為噬菌體的合成和改造提供了更精確控制的可能性。

人工細胞的構(gòu)筑：構(gòu)建具有生命基本特征的人工細胞是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)，至今對其仍然沒有一個明確的定義。盡管生命系統(tǒng)具有高度的內(nèi)在復(fù)雜性，但一般認為具備5個共同特征：區(qū)室化、生長分裂、信息處理、能量轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)性。利用分子生物學(xué)工具和方法，自下而上將功能分子組裝成人工細胞，雖可實現(xiàn)基本的生命特征，但在實現(xiàn)自組裝、自我繁殖等方面面臨重大挑戰(zhàn)。目前大量利用無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)模擬細胞結(jié)構(gòu)和特征的工作已經(jīng)開展，如分子擁擠、區(qū)室化、基因噪聲、網(wǎng)絡(luò)、動態(tài)行為和細胞通訊，致力于構(gòu)建更“完美”的人工細胞。

 

圖 | 人工細胞的構(gòu)建（來源：CSCD）

脂質(zhì)體因其良好的生物相容性、生物可降解性、易制備和高包封性等特點［148］，最常用來構(gòu)筑人工細胞。

在區(qū)室化構(gòu)筑的研究中，研究最多的是基于囊泡和人工制備脂質(zhì)體的人工細胞，脂質(zhì)囊泡可以高效地包裹無細胞系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達，從而形成高效可控的人工細胞系統(tǒng)。此外，微流控技術(shù)可以通過調(diào)整流速和通道尺寸精確控制液滴大小和形狀，在人工細胞構(gòu)筑方面受到越來越多的關(guān)注。

細胞通訊或信息傳遞作為生命體系的重要特征，亦是人工細胞構(gòu)建的主要目標之一，通常通過物理或化學(xué)信號遞送來實現(xiàn)。

隨著基于無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的人工細胞的發(fā)展，從進化生物學(xué)基礎(chǔ)研究到生物醫(yī)療應(yīng)用研究都得到廣泛拓展。該團隊通過使用基于磷脂的囊泡展示了原始細胞的生長-分裂機制；人工細胞的發(fā)展還推動了無細胞生物傳感的研究；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可將人工細胞構(gòu)筑用于藥物篩選。

然而，要真正實現(xiàn)“完美”人工細胞的構(gòu)建，還需要實現(xiàn)自我復(fù)制、新陳代謝和信息處理等復(fù)雜功能，這仍然需要未來在相關(guān)領(lǐng)域的進一步拓展。

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)機遇和挑戰(zhàn)

綜上所述，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為一種強大的合成生物學(xué)技術(shù)平臺，因其開放性、可控性、高效性、靈活性等諸多優(yōu)點，在過去5～10年時間里得到了多樣化的大力發(fā)展，其應(yīng)用跨越了生物制造、生物催化、生物醫(yī)藥、生物傳感、人工細胞等重要基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域。各種不同的CFPS技術(shù)平臺進一步使具有不同復(fù)雜性和物種來源的蛋白質(zhì)的體外生產(chǎn)成為可能。

然而，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展中，仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。

規(guī)模化和成本是工業(yè)制造中的兩大關(guān)注點。該系統(tǒng)的進一步發(fā)展需要無細胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)規(guī)模的擴大。一些難合成蛋白質(zhì)的生產(chǎn)離不開動物和昆蟲細胞提取物，而這些提取物的制備較為繁瑣，有些耗時較長，是擴大工業(yè)化生產(chǎn)有待解決的一大問題。

與此同時，一些應(yīng)用的發(fā)展常常受到試劑費用的限制。例如，在大腸桿菌CFPS系統(tǒng)中，如果以質(zhì)粒為表達模板，以葡萄糖為供能系統(tǒng)，合成非天然綠色熒光蛋白每100 μg的總成本為0.658美元。為進一步提高產(chǎn)量、擴大生產(chǎn)規(guī)模，可從以下幾個方面尋求解決策略：簡化提取物制備程序、開發(fā)蛋白質(zhì)合成的新能源再生系統(tǒng)、穩(wěn)定底物供應(yīng)和制備高效的正交翻譯系統(tǒng)。

在未來的發(fā)展中，無細胞體系需要進一步優(yōu)化以提高效率、降低成本，同時提高生物大分子（RNA和蛋白質(zhì)）合成的個性化、多樣化、普適性和穩(wěn)定性；無細胞系統(tǒng)的使用壽命需進一步延長，需要朝著能夠?qū)崿F(xiàn)自我復(fù)制的無細胞合成系統(tǒng)邁進；需要進一步融合先進材料學(xué)、人工智能和生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域，展現(xiàn)出無細胞合成系統(tǒng)更廣泛的應(yīng)用潛力。

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