源起基金關注領域——類器官行業(yè)（二）
四、類器官的培養(yǎng)
除了成體干細胞，多能干細胞也可以利用其自我更新及分化能力來制備類器官。由于從多能干細胞中提取的類器官是通過同質群體定向分化而形成的，因此必須在一個喚醒胚胎發(fā)生的動態(tài)過程中重新創(chuàng)造組織特異性細胞類型及其微環(huán)境。
因此，多能干細胞類器官培養(yǎng)必須在分化過程中提供合適的生態(tài)位信號。由于這一過程較復雜，多能干細胞類器官往往含有不同于模型器官的細胞類型，使靶組織的信號環(huán)境和自組織復雜化。
（一）培養(yǎng)流程和條件
類器官的培養(yǎng)從獲取組織樣本開始，經歷冷鏈運輸至實驗室、自動化儀器解離細胞、類器官培養(yǎng)、類器官鑒定等環(huán)節(jié)，得到高質量類器官。類器官的形成和成熟是在單細胞或小細胞簇擴展和重組之前進行的。
類器官培養(yǎng)首先要分離出胚胎或多能干細胞，然后將其培養(yǎng)在一個支持介質上，進行三維生長。介導類器官形成的信號通路與體內器官發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持的信號通路相同，在培養(yǎng)過程中需要添加各種細胞因子，以激活或抑制參與類器官形成的信號通路。制備不同類器官需要使用不同細胞因子組合。已經開發(fā)了各種工作流程來生成類器官，特殊類器官需要獨特培養(yǎng)方法，并不是所有通用工作流程都適用。
培養(yǎng)流程的關鍵環(huán)節(jié)是樣本制備和細胞培養(yǎng)條件控制及生長因子的選擇。類器官建立基本流程如下：首先獲得組織，組織類型主要包括正常組織、腫瘤組織和活檢組織。
針對手術切除的組織在消化解離前需要先剔除沒用的部分，也就是脂肪和肌肉組織。剔除之后進一步進行消化解離，取一部分保存進行分子生物學實驗，剩余部分包裹在基質膠中，然后滴注到培養(yǎng)板上形成PDO，生長到一定程度之后進行傳代和藥敏實驗。
圖|從原生組織培養(yǎng)口腔黏膜類器官的過程
類器官培養(yǎng)試劑主要包括消化液、基質膠(Matrigel等)、維持類器官生態(tài)所需因子和分化所需因子這幾個主要元素。基質膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結構提供基質。維持類器官生態(tài)因子主要目的為促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡等。
這些試劑在不同實驗室、公司以及培養(yǎng)不同種類的類器官之間差異性較大。類器官作為新型藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是遠高于細胞系，成本占比較高的包括基質膠和細胞因子。
1.樣本來源
類器官建立成功與否很大程度上取決于取到的組織標本，新鮮組織還有豐富上皮組織的樣本更容易培養(yǎng)出PDO，所以要把前期工作做好，樣本保持在4℃ DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，并添加10μM的Y-27632能夠更好地保持細胞活性。
2.培養(yǎng)基
類器官的構建依賴于3D培養(yǎng)環(huán)境，其中懸浮的培養(yǎng)基品質是關鍵，一類是基礎培養(yǎng)基，一類是另外添加的各種因子。最常用的培養(yǎng)基是基底膜提取物/基質膠(BME)，BME包含多種組分如膠原蛋白IV、層粘連蛋白等，對于維持干細胞或前體細胞未分化狀態(tài)有重要作用，并不是單純提供一種固態(tài)支持的作用。在某些情況下，類器官可以在沒有細胞外基質的情況下成功培養(yǎng)，例如乳腺腫瘤生長和分化的乳腺細胞系。
3.生長因子
生長因子是類器官培養(yǎng)基的重要組成部分，因為它們通過一系列信號通路組合的操作來指導干細胞的分化，這些信號通路可以生成和維持特定的類器官類型。
基礎培養(yǎng)基之外的生長因子會隨著腫瘤類型的不同而發(fā)生變化，但基本上都會包含著四類因子：Wnt信號通路激活劑；酪氨酸受體激酶的配體，刺激上皮細胞增殖；TGF-β信號通路抑制劑，抑制上皮細胞分化；ROCK抑制劑，保持干細胞多能性。
圖|類器官生產中的生長因子和小分子抑制劑及其作用
4.基質膠
基質膜是特定細胞外基質，在內皮細胞、上皮細胞、肌肉或神經細胞間形成界面，不僅可以支持細胞層，還在組織形成中影響細胞粘附、遷移、增殖和分化。
全球領先的基質膠/基底膜提取物，提取于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤，在37℃重新形成基底膜，其主要成分是膠原蛋白IV、層粘連蛋白等，還包含生長因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF等，主要用于支持細胞生長和分化，也用于細胞粘附、血管新生、提取外細胞遷移/侵襲和體內成瘤實驗等。對于維持干細胞或前體細胞未分化狀態(tài)有重要作用，并不是單純提供一種固態(tài)支持的作用。
（二）人源腫瘤類器官PDO的培養(yǎng)方法
PDO的樣本來源通常為腫瘤組織或者胸腹水等惡性積液，主流培養(yǎng)方法包括較為常用的正置膠滴法、適用于腫瘤和睪丸類器官培養(yǎng)的倒置膠滴法、適用于有氣體接觸的黏膜類器官(腸、呼吸道)培養(yǎng)的氣液界面法以及需要較大擴增(腦類器官)的生物反應器法等。
首先將患者來源的腫瘤樣本組織通過機械剪切得到腫瘤細胞團，再將細胞團酶消化成單細胞。分離消化后，將細胞嵌入到基質膠中并在96/384孔板上進行膠滴的種接，再覆蓋以培養(yǎng)基和細胞因子培養(yǎng)。類器官培養(yǎng)至直徑幾百微米的細胞小球即可用于藥篩。
正置膠滴法是較為常用的類器官培養(yǎng)方法，倒置膠滴法又叫懸滴法，是近年來細胞三維培養(yǎng)的一種，操作簡便，可以在懸浮狀態(tài)下自發(fā)成球。
懸滴細胞培養(yǎng)方法是通過將單細胞懸液形成一個個獨立懸滴，細胞在懸滴內聚集成細胞球。氣液界面培養(yǎng)被認為是呼吸系統(tǒng)生理學高度相關的培養(yǎng)體系，能夠克服2D培養(yǎng)的許多挑戰(zhàn)。
生物反應器法是以生物反應器為核心，通過懸浮或者支架貼壁的方式在生物反應器內構建3D培養(yǎng)環(huán)境，采用工程技術手段對生物反應器內的環(huán)境參數(shù)如溫度、pH值及溶解氧濃度等實時在線測控，并輔以循環(huán)灌注的手段，加強營養(yǎng)傳輸和物質交換，從而構建適合細胞生長增殖的培養(yǎng)條件。動物細胞體外培養(yǎng)時，生物反應器是整個培養(yǎng)過程的關鍵設備，為細胞提供了一個適宜的生長環(huán)境，使之快速增殖并形成所需的生物組織制品。
（三）科學研究中的類器官培養(yǎng)
1.上皮類器官研究上皮細胞-免疫細胞相互作用
上皮細胞出現(xiàn)在機體所有和外界接觸的邊界，比如皮膚，呼吸道，肺，消化道，是機體對抗病原體侵染的第一層屏障，也是第一個對病原性感染作出反應的細胞。為了維持體內平衡，并提供對感染的快速反應，上皮細胞與免疫細胞密切配合。
所以，在上皮區(qū)域，也是全身免疫細胞濃度最高的區(qū)域。建立上皮細胞和免疫細胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和損傷后免疫的重要手段。上皮細胞類器官的建立，可以非常精準的模擬機體上皮環(huán)境，也被發(fā)展起來研究上皮和免疫細胞相互作用。有三種共培養(yǎng)模式：
①用存在于細胞外基質中的重組細胞因子處理類器官，評價免疫細胞衍生細胞因子對于上皮細胞的影響。如IL-4和IL-13促進叢生細胞分化，而IL-22支持干細胞增殖和存活。
②將器官消化到單個細胞，然后在免疫細胞存在的情況下，再生長。用于評估免疫細胞和免疫細胞衍生的細胞因子(可溶性或膜結合)對器官生長和分化的影響，以及上皮細胞對免疫細胞表型的影響。
③在ECM或生長培養(yǎng)基(懸浮培養(yǎng))中，向完整類器官中添加(活化的)免疫細胞，如T細胞或固有淋巴樣細胞(ILCs)，以評估免疫細胞與上皮細胞之間的相互作用。這些檢測的讀數(shù)通常包含消化形成的器官和隨后的轉錄。單細胞RNA測序或定量PCR，成像和/或流式細胞術評估上皮細胞和/或免疫細胞表型。在這些共培養(yǎng)中使用的免疫細胞或者直接從小鼠組織中分類，或者直接從人外周血中提取，或者先在體外分化。
圖|上皮類器官三種共培養(yǎng)模式
2.胸腺類器官研究T細胞發(fā)育
胸腺是T細胞成熟和從祖細胞向成熟的幼稚淋巴細胞分化的中心部位。來源于骨髓的T細胞祖細胞在胸腺皮質進行陽性選擇，隨后在胸腺髓質中進行陰性選擇。胸腺的這些區(qū)域由兩種不同的上皮細胞組成，皮質胸腺上皮細胞(CTECs)和髓質胸腺上皮細胞(MTECs)。
3D重建胸腺被證明是模擬其功能的關鍵，幾種胸腺類器官的產生方法：器官培養(yǎng)通常是從人類身上建立起來的或胎鼠或新生兒胸腺組織，但也有報道稱TEC樣細胞與人胚胎干細胞的體外分化，這些培養(yǎng)都產生胸腺樣結構。
在體外產生活的T細胞，并在移植到裸鼠上時發(fā)揮作用。雖然長時間的類似胸腺的培養(yǎng)是可能的(離體培養(yǎng)長達56天)，但細胞在連續(xù)傳代時失去了集落形成能力。
重要的是，雖然在成年小鼠中已經發(fā)現(xiàn)了一種雙能的TEC前體，但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未從單個干細胞中生成。此外，考慮到小鼠體內某些雙能TEC前體的生長因子已被發(fā)現(xiàn)(例如BMP 4和IL-22)，可以嘗試這些因子是否可用于維持TEC的祖細胞來源的類器官。
（四）腫瘤微環(huán)境
兩種主要的方式被使用。以非小細胞肺癌為例，在整體方法中，腫瘤活檢組織是在氣液界面間環(huán)境培養(yǎng)，所有腫瘤細胞類型的細胞懸液，包括內源性免疫細胞和其他非上皮細胞類型，促進腫瘤特異性T細胞的生長。
在還原模擬方法中，上皮類器官是從腫瘤活檢組織中生長出來的，然后與來自同一患者外周血的自體免疫細胞共培養(yǎng)，以促進腫瘤反應細胞的連續(xù)擴張。雖然整體方法允許包括整個腫瘤微環(huán)境的腫瘤材料的培養(yǎng)，因此與體內情況非常相似，但不易長時間維持，而還原模擬方法允許腫瘤上皮的長期培養(yǎng)和擴展，這使得更廣泛，更長期的研究成為可能。
（五）藥物篩選
1.促進心肌纖維細胞生長化合物篩選
由于許多功能和生物學特性的物種差異很大，動物模型對人類心臟疾病和藥物安全性的推斷很差。人類多能干細胞(hPSC)可以為生物醫(yī)學和藥物研究提供無限的人類心肌細胞來源，有可能彌合這一鴻溝。然而傳統(tǒng)2D培養(yǎng)中的hPSC源性心肌細胞缺乏功能成熟，這在某些情況下阻礙了它們準確預測人類生物學和病理生理學的能力。
多細胞3D人體類器官提供了更精確的模型，是解決這一問題的潛在方法。澳大利亞昆士蘭大學生物醫(yī)學系的科學家基于96孔板培養(yǎng)心臟心肌類器官，進而進行化合物篩選，從5000種化合物中篩選出不同功能化合物。
2.特定神經類器官培養(yǎng)及藥物篩選等應用
神經球在不同分化培養(yǎng)基種培養(yǎng)(具體誘導因子及生長因子見下圖)，產生大腦，中腦，海馬，前腦等不同腦部類器官。
圖|神經球在不同分化培養(yǎng)基種培養(yǎng)產生不同腦部類器官
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