五、CAR-T療法

 

（一）主要適應(yīng)癥和常見血液瘤流行病學(xué)

淋巴瘤、白血病及多發(fā)性骨髓瘤等血液疾病是中國常見的惡性腫瘤，血液瘤診斷通常是骨髓檢查和影像檢查。大部分患者會(huì)選擇化療、靶向藥、免疫藥物治療，條件合適的患者會(huì)選擇骨髓移植。當(dāng)前療法的主要缺陷體現(xiàn)在總反應(yīng)率低、復(fù)發(fā)率高、副作用大、治療周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴。由于關(guān)鍵藥物的缺失、輔助療法的不足、早期診斷率的低下，我國血液瘤5年存活率較低，非霍奇金氏淋巴癌和多發(fā)性骨髓瘤的5年存活率分別約為37%和25%，遠(yuǎn)低于美國同期適應(yīng)癥存活率。復(fù)雜性及復(fù)發(fā)性的惡性血液病缺少有效治療手段，CAR-T療法獲批產(chǎn)品多用于四線、三線治療，用于二線、一線適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

圖｜血液腫瘤CAR-T商業(yè)化產(chǎn)品

淋巴瘤是淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞)等在淋巴結(jié)中癌變導(dǎo)致的一種惡性腫瘤，常見的發(fā)病區(qū)包括脖頸、腋下、腹部、骨盆等。根據(jù)發(fā)病時(shí)細(xì)胞形態(tài)的不同，淋巴瘤分為兩類，霍奇金淋巴瘤(HL)約占10%，非霍奇金淋巴瘤(NHL)約占90%白血病根據(jù)發(fā)病細(xì)胞的不同，可以分為淋巴細(xì)胞白血病(LL)和髓細(xì)胞白血病(ML)，根據(jù)發(fā)病急緩又可以進(jìn)一步分為急性和慢性，淋巴性白血病ALL和CLL，髓細(xì)胞白血病AML和CML。

圖｜CAR-T療法主要適應(yīng)癥

血液瘤主要包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)，2020年全球分別新增約54萬和18萬患者，死亡人數(shù)分別為26萬和12萬。非霍奇金氏淋巴瘤包括多種淋巴瘤，其中最為普遍的是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡型淋巴瘤。我國非霍奇金氏淋巴癌和多發(fā)性骨髓瘤2020年新增患者分別約9萬和2萬，且呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。

CD19是B細(xì)胞增殖、分化、活化及抗體產(chǎn)生有關(guān)的重要膜抗原，是B細(xì)胞淋巴瘤的最好標(biāo)記；BCMA在漿細(xì)胞中高水平選擇性表達(dá)，是理想的多發(fā)性骨髓瘤治療靶點(diǎn)。

圖｜常見血液瘤流行病學(xué)

（二）CAR-T療法面對(duì)的挑戰(zhàn)和解決策略

 

CAR-T療法取得了巨大成功，但在有效性、安全性和可獲得性方面仍存在諸多挑戰(zhàn)。

圖｜CAR-T療法挑戰(zhàn)和策略

1.持久性不足，高復(fù)發(fā)

CAR-T治療疾病的復(fù)發(fā)，主要由于CAR-T持久性和增殖能力不足導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭，無法繼續(xù)提供腫瘤殺傷作用，增強(qiáng)型CAR-T是T細(xì)胞耗竭破局關(guān)鍵點(diǎn)，雙/多靶點(diǎn)CAR-T可提高抗原覆蓋率。

基于細(xì)胞因子相關(guān)通路的增強(qiáng)型CAR-T可改善細(xì)胞擴(kuò)增能力和持久性。通過工程改造以表達(dá)細(xì)胞因子及其受體，細(xì)胞因子可以自分泌方式增加T細(xì)胞的存活和擴(kuò)增，以旁分泌方式發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)周圍環(huán)境，干擾TME中存在的免疫抑制細(xì)胞因子。阻斷免疫檢查點(diǎn)，不能逆轉(zhuǎn)耗竭，但可加強(qiáng)持久性。通過基因編輯敲除免疫檢查共抑制分子PD-1、CTLA-4、TIM3和TIGIT，表達(dá)分泌免疫檢查點(diǎn)抗體，或與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用。

雙/多靶點(diǎn)CAR-T提升有效率，降低復(fù)發(fā)率。通過提高抗原覆蓋率，克服抗原逃逸與抗原異質(zhì)性，臨床證實(shí)能夠提升CAR-T有效率并降低復(fù)發(fā)率，長(zhǎng)期緩解待更長(zhǎng)時(shí)間驗(yàn)證。進(jìn)入臨床階段的雙/多靶點(diǎn)項(xiàng)目90個(gè)左右，靶點(diǎn)組合主要集中在常見成熟靶點(diǎn)，如CD19、CD20、CD22、BCMA，CD19占據(jù)半數(shù)以上。

圖｜常見雙靶CAR模式

2.實(shí)體瘤靶點(diǎn)缺乏，腫瘤微環(huán)境抑制免疫

實(shí)體瘤由于特異性靶點(diǎn)缺乏，以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性等原因，對(duì)細(xì)胞治療反應(yīng)不佳。尋找差異化靶點(diǎn)，創(chuàng)新策略設(shè)計(jì)CAR-T，采用替代療法TIL、TCR-T和CAR-M，可助力CAR-T攻克實(shí)體瘤。

CAR-T治療實(shí)體瘤有主要三個(gè)障礙。首先，腫瘤內(nèi)部細(xì)胞抗原復(fù)雜，靶抗原選擇和CAR-T抗原結(jié)合域組合設(shè)計(jì)是難題，治療后容易導(dǎo)致靶抗原下調(diào)或者丟失。其次，CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)侥[瘤并保證活性和穿透性是決定療效的重要因素。最后，實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境(TME)與血液瘤不同，還包括浸潤(rùn)性和駐留免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及許多促炎和抗炎介質(zhì)，相互作用復(fù)雜，多數(shù)情況下會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞引起的抗腫瘤和免疫反應(yīng)。

針對(duì)這三個(gè)障礙采取相應(yīng)策略來提高CAR-T細(xì)胞功能。

從腫瘤抗原著手增強(qiáng)特異性，新一代基因組和蛋白組學(xué)研究著重于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤特異性抗原，現(xiàn)在臨床應(yīng)用多是針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的改進(jìn)，例如調(diào)節(jié)scFv或VHH的親和力，或設(shè)計(jì)可以靶向多個(gè)腫瘤抗原/腫瘤干細(xì)胞的CAR，CAR的設(shè)計(jì)是實(shí)體瘤中應(yīng)用的主要壁壘。

增強(qiáng)到達(dá)腫瘤部位的T細(xì)胞活性和浸潤(rùn)冷腫瘤能力。讓CAR-T細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位再被激活，如將CAR改造成多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)，或利用TME缺氧、synNotch受體調(diào)控表達(dá)，或表達(dá)一個(gè)靶向正常組織抗原的抑制CAR(CD19/PSMA)。工程菌提供Target，精準(zhǔn)定位腫瘤，工程菌選擇性地在腫瘤中生長(zhǎng)，內(nèi)含同步裂解電路，在腫瘤中裂解釋放出 ProCAR-Target，招募CAR-T至腫瘤細(xì)胞。增強(qiáng)T細(xì)胞活性，例如增加CAR共刺激或激活區(qū)域，表達(dá)激活免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子或腫瘤分泌的趨化因子，如IL7xCCL19 CAR-T。

實(shí)體瘤中混雜了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，髓系來源抑制細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等，這些細(xì)胞會(huì)激活腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，抑制免疫系統(tǒng)。成纖維細(xì)胞激活蛋白FAP-CAR-T能有效地克服物理屏障和TME滲透進(jìn)腫瘤巢，與TAA靶向的Meso-CAR-T順序給藥，可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)和殺傷性。靶向TAM的CD123或FRβ-CAR-T均在臨床前展現(xiàn)了優(yōu)秀的抗腫瘤反應(yīng)。另外TME中細(xì)胞表達(dá)多種免疫檢查點(diǎn)蛋白，阻斷 PD-1/PD-L1可直接對(duì)抗免疫抑制反應(yīng)，或表達(dá)顯性失活/細(xì)胞因子開關(guān)受體來把抑制信號(hào)轉(zhuǎn)換成生長(zhǎng)激活信號(hào)，其中IL-4/IL-2 細(xì)胞因子開關(guān)正在早期臨床驗(yàn)證中。

圖｜已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的CAR-T實(shí)體瘤靶點(diǎn)

替代療法TIL和TCR-T、CAR-M。TIL細(xì)胞療法制備難度大、操作流程復(fù)雜、商業(yè)化具備風(fēng)險(xiǎn)，制備工藝優(yōu)化縮短制備時(shí)間和使用基因修飾方案打造基因編輯型TIL提高靶向性/療效成為主要發(fā)展趨勢(shì)。TCR-T未來趨勢(shì)可重點(diǎn)關(guān)注靶點(diǎn)選擇和突破HLA限制性，安全有效的靶點(diǎn)選擇是TCR-T細(xì)胞療法成功關(guān)鍵，優(yōu)化的TCR可以高親和力結(jié)合腫瘤細(xì)胞內(nèi)/外抗原，降低HLA限制性，提高腫瘤殺傷效力，目前通用型TCR-T研究處于探索階段。CAR-M是解決實(shí)體瘤TME痛點(diǎn)的新探索，處于早期研發(fā)階段，目前僅有1個(gè)項(xiàng)目進(jìn)入臨床階段。巨噬細(xì)胞容易浸潤(rùn)腫瘤環(huán)境，特異性CARs修飾巨噬細(xì)胞，滲入TME并發(fā)揮靶向效應(yīng)子功能，吞噬腫瘤細(xì)胞，抗原呈遞來激活T細(xì)胞。

圖｜CAR-M吞噬腫瘤細(xì)胞及抗原呈遞機(jī)制圖

圖｜CAR-M制備技術(shù)路線與主要細(xì)胞來源途徑

3.細(xì)胞因子風(fēng)暴和非靶向腫瘤毒性

設(shè)計(jì)可調(diào)節(jié)開關(guān)CAR-T和邏輯門控CAR-T精準(zhǔn)靶向，減少脫靶毒性。安全開關(guān)和邏輯門控精準(zhǔn)調(diào)控CAR-T殺傷活性，開關(guān)可調(diào)節(jié)(on/off switchable)CAR-T通過多種開關(guān)設(shè)計(jì)策略，使CAR-T在開關(guān)之間靈活切換，邏輯門控通過對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞抗原的區(qū)分，控制CAR-T僅殺傷腫瘤細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞，精準(zhǔn)殺瘤，限制脫靶毒性。

圖｜常見CAR-T開關(guān)設(shè)計(jì)

圖｜邏輯門控CAR-T

4.制備流程復(fù)雜，價(jià)格昂貴

自體CAR-T生產(chǎn)復(fù)雜耗時(shí)，需要提取患者自身的T細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造、擴(kuò)增并回輸。由于T細(xì)胞具備免疫原性，需要每個(gè)患者一批次，導(dǎo)致生產(chǎn)檢測(cè)成本高達(dá)10-20萬美金/人份，從而影響藥物的商業(yè)化放量。在經(jīng)歷多線治療后并非所有患者自身T 細(xì)胞都足夠健康可以進(jìn)行改造，約 5%的患者自體T細(xì)胞無法改造生產(chǎn) CAR-T。制備時(shí)間需要2-3周，患者等待時(shí)間較長(zhǎng)，獲批的末線血液瘤惡化迅速，少數(shù)患者會(huì)在等待制備的時(shí)間中病情惡化死亡。

快速CAR-T療法，異體CAR-T,In Vivo CAR-T和替代療法CAR-NK可改進(jìn)制備流程，降低成本。

圖｜CAR-T療法制備流程

快速CAR-T療法改進(jìn)了傳統(tǒng)自體療法的制備時(shí)間和T細(xì)胞干性，早期臨床展現(xiàn)出與傳統(tǒng)方法相當(dāng)?shù)陌踩院陀行浴ＶZ華和亙喜生物的快速CAR-T技術(shù)平臺(tái)，可以把行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制備時(shí)間縮短到2天內(nèi)，CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染和激活同步進(jìn)行，同時(shí)省去1-5周的體外擴(kuò)增環(huán)節(jié)。這使T細(xì)胞受損程度和耗竭相應(yīng)減少，強(qiáng)化T細(xì)胞的適應(yīng)性，更為患者提供了及時(shí)治療，顯著降低生產(chǎn)的人工和耗材成本。

快速CAR-T技術(shù)平臺(tái)臨床進(jìn)展(截至2022年1月)

異體CAR-T的制備從健康T細(xì)胞供體開始，使用病毒載體侵染敲除T細(xì)胞受體(TCR)的αβ亞基和CD52，再進(jìn)行激活和擴(kuò)增，剩余的有αβ亞基TCR的T細(xì)胞則使用抗αβ亞基TCR抗體磁珠去除，最后凍存?zhèn)溆谩．愺wCAR-T具備批量生產(chǎn)、現(xiàn)貨取用、可多次給藥、價(jià)格適中的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)存在兩個(gè)待解決問題，基因編輯風(fēng)險(xiǎn)、GvHD、攻擊宿主細(xì)胞、淋巴耗竭風(fēng)險(xiǎn)，以及體內(nèi)存活時(shí)間短，僅幾周到幾個(gè)月。多個(gè)異體CAR-T項(xiàng)目進(jìn)入臨床階段，免疫排斥為重點(diǎn)關(guān)注問題，現(xiàn)今臨床效果難以超越自體CAR-T。基本采取TRAC敲除方式，也有通過多基因敲除解決T細(xì)胞存活時(shí)間的嘗試，或嘗試同時(shí)敲除PD-1，防止出現(xiàn)T細(xì)胞被免疫抑制的問題。

圖｜自體異體CAR-T比較

圖｜異體CAR-T臨床階段項(xiàng)目

解決異體CAR-T免疫排斥常用方法是敲除異體CAR-T細(xì)胞上的MHC I(B2M)，但HLA I完全缺失的細(xì)胞容易被NK細(xì)胞識(shí)別并殺死(基于missing self recognition)，解決方案之一是加入HLA-E或HLA-G。也可選用不同T細(xì)胞亞型，多種T細(xì)胞亞型無MHC限制性，進(jìn)行工程化CAR改造，已顯示出臨床治療潛力，而且具有降低GvHD潛在優(yōu)勢(shì)。異體γδ-T細(xì)胞不依賴MHC結(jié)合的靶細(xì)胞抗原識(shí)別特性，可防止引起GvHD，更方便應(yīng)用于異體通用式療法，適應(yīng)癥以實(shí)體瘤為主，最快進(jìn)行至臨床Ⅰ期。

圖｜不同T細(xì)胞亞型

In Vivo CAR-T省去復(fù)雜的體外制造過程，簡(jiǎn)化生產(chǎn)治療流程，縮短了時(shí)間，使治療更及時(shí)，還可以規(guī)避GvHD，降低治療風(fēng)險(xiǎn)，減少不良事件的發(fā)生。目前In Vivo CAR-T處于早期探索階段，多家國外企業(yè)布局，國內(nèi)企業(yè)鮮有布局，泰遠(yuǎn)生物和臻愈生物進(jìn)軍這一領(lǐng)域。靶向基因遞送的準(zhǔn)確性對(duì)In Vivo CAR-T細(xì)胞生成至關(guān)重要，臨床前結(jié)果初步驗(yàn)證成效。

圖｜In Vivo CAR-T體內(nèi)遞送策略關(guān)鍵特點(diǎn)

現(xiàn)貨型CAR-NK療法有望解決可及性。與CAR-T相比，CAR-NK具有天然的抗腫瘤毒性和更好的通用型產(chǎn)品潛力，NK細(xì)胞來源多樣，同種異體的安全性也更好，不會(huì)引起GVHD和明顯毒性。NK細(xì)胞制備途徑廣泛、成本低，可以從外周血(PB)、臍帶血(UCB)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)及NK-92細(xì)胞系等多渠道獲取。NK細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間較短，CAR-NK安全性更高，可降低移植物抗宿主病(GvHD)，細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)風(fēng)險(xiǎn)。CAR-NK更有利于成為“現(xiàn)貨型”免疫細(xì)胞療法產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，兼具治療費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。

CAR-NK目前早期臨床治療血液瘤和實(shí)體瘤的有效性和持久性遠(yuǎn)遜于CAR-T療法，且需要抗體藥物聯(lián)用，多次進(jìn)行清除淋巴細(xì)胞和輸注療程，但因安全性優(yōu)秀，更多研發(fā)投入在改進(jìn)其療效上。多重基因修飾提高有效性，克服NK細(xì)胞功能衰竭、自相絞殺、細(xì)胞毒性低、腫瘤免疫環(huán)境抑制等不足。異位表達(dá)趨化因子受體增強(qiáng)NK細(xì)胞的運(yùn)輸和浸潤(rùn)腫瘤的能力，敲除NK免疫功能負(fù)調(diào)節(jié)因子基因/干預(yù)代謝途徑克服功能衰竭，敲除表面和細(xì)胞內(nèi)分子防止自相殘殺或免疫抑制來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合治療，抑制性受體的靶向基因消融保護(hù)CAR-NK細(xì)胞對(duì)抗免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。